摘要：目的 分析美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment, MEBO)对高糖培养的成纤维细胞外泌体分泌的影响，探究MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的机制。方法 首先将Wistar大鼠表皮于无菌环境中分离。培养分离后的成纤维细胞，等到第四代，根据课题组前期研究将细胞分成四组，分别为对照组(高糖培养基)、MEBO低浓度组(20 g/L)、MEBO中浓度组(40 g/L)、MEBO高浓度组(80 g/L)。药物干预3天后，收集细胞上清用超滤管浓缩后，用SBI试剂盒提取外泌体，采用Western blotting检测外泌体标记蛋白CD81、TSG101。结果 外泌体标记蛋白CD81、TSG101在MEBO组和对照组中均有表达。MEBO各浓度组外泌体分泌量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),MEBO中浓度组(40 g/L)分泌外泌体最多，与MEBO低浓度组(20 g/L)、MEBO高浓度组(80 g/L)相比差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 MEBO可以促进高糖培养的成纤维细胞分泌外泌体。

摘要：目的:体外高糖培养成纤维细胞(fibroblasts,FB),观察美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT)促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,(1)采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;(2)采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期(第3天)的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组(除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基)。分别予:(1)免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;(2)透射电镜检测细胞自噬体;(3)q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;(4)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:(1)细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度(optical density,OD)值均高于对照组(P<0.05),细胞增殖率在第72小时最高;(2)划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:(1)免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;(2)电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;(3)q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;(4)蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。

摘要：目的体外观察湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对糖尿病大鼠慢性创面纤维细胞生长的影响,探讨MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的机制。方法首先建立糖尿病创面大鼠模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成对照组、MEBO组(1 g/L),采用CCK-8法检测12、24、48、72、96 h细胞增殖情况,采用细胞划痕来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。结果 48 h起MEBO组各个时间点的OD值均高于对照组(P<0.05或0.001),细胞增殖率在72 h达到高峰;划痕实验检测显示,MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MEBO可促进糖尿病大鼠慢性创面成纤维细胞增殖与迁移能力。

摘要：研究背景和目的糖尿病创面是糖尿病常见并发症,具有病程长、易复发等特点,给患者带来极大困扰,探寻其病理机制及治疗具有重要意义。巨噬细胞和成纤维细胞是创面中的重要效应细胞。现发现ADAM-10调控细胞粘附、生长、迁移等过程。但ADAM-10在糖尿病创面中的具体机制尚不明确。本研究探究ADAM-10在巨噬细胞、成纤维细胞中的调控作用;及其在糖尿病创面愈合过程中的作用机制;结合药物治疗创面,验证研究结果。研究方法1.临床上筛选慢性难愈合创面,随机分组:湿润暴露疗法/湿润烧伤膏(MM)组、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(rb-b FGF)组。在治疗第3、10天,取肉芽及少量上皮组织,免疫荧光(IF)染色ADAM-10、MMP-12,观察蛋白变化特点。2.对sh ADAM-10 RAW264.7细胞进行蛋白组学分析,筛选差异蛋白,并进行生物信息学分析。3.对RAW264.7和J774a.1细胞,进行sh ADAM-10(sh)或EX ADAM-10(EX)干预,随后给予脂多糖(LPS)或MMP-12抑制剂+LPS(MMP-12inh+LPS)刺激,检测细胞活力、基因转录、蛋白表达等情况。4.对L929成纤维细胞进行EX干预,随后LPS刺激,观察细胞活力、ADAM-10以及其它蛋白表达水平。5.正常、糖尿病大鼠分别制备创面,分组为急性(Acute)组、模型(Model)组、MM组以及rb-b FGF组。观察第3、7、10、14天的创面情况;创面率;病理结构;亚细胞结构;ADAM-10转录水平;蛋白表达及定位情况。结果1.慢性难愈合创面治疗第3天,MM组内ADAM-10、MMP-12表达均低于rb-b FGF组。相较于治疗第3天,第10天ADAM-10表达增加;MMP-12降低;MM增加ADAM-10作用低于rb-b FGF;rb-b FGF降低MMP-12作用明显。2.sh RAW264.7细胞蛋白组学检测结果显示:干扰ADAM-10影响创面愈合相关的多种生物学过程,并导致MMP-12和AKT降低。3.巨噬细胞中(1)对较于CON组,1000ng/ml的LPS作用9 h～24 h增加细胞活力(P<0.05);1.5μmol/L的MMP-12inh作用12 h～36 h对细胞活力无影响(P>0.05)。LPS作用12 h显著降低ADAM-10、增加MMP-12基因转录水平(P<0.01);LPS增加MMP-12、i NOS、T...