摘要：目的:我国有超过1.4亿糖尿病人,糖尿病药物研发在我国拥有巨大的市场需求,同时用于糖尿病药物研发的实验动物的需求也与日俱增。我们建立一种使用无脊椎动物家蚕(Bombyx mori)来构建糖尿病创面模型,探讨家蚕糖尿病创面愈合中PI3K-Akt信号通路的调控作用,为研究家蚕糖尿病创面模型提供一定的理论基础,为筛选治疗糖尿病创面的药物或疗法提供低成本的动物模型。方法:(1)不同浓度的葡萄糖混合桑叶饲养家蚕36 h后,每间隔30 min测量家蚕餐后血淋巴葡萄糖水平,观察家蚕血淋巴葡萄糖耐量情况。(2)不同浓度的葡萄糖混合桑叶饲养家蚕,每间隔12 h测量家蚕餐后血淋巴葡萄糖水平,称量家蚕的体重,观察建模后84 h家蚕体型变化,120 h结茧情况,评估不同浓度葡萄糖对家蚕生长的影响。(3)MEBT/MEBO作为阳性治疗对照组,收集家蚕创面组织进行苏木精-伊红染色和改良马松染色,观察家蚕创面组织的生长情况。(4)通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测家蚕创面组织中相关因子的转录及蛋白表达水平。结果:(1)家蚕血淋巴中葡萄糖浓度随着进食总体呈现先升高后降低,空腹时高糖各组血淋巴葡萄糖浓度高于空白组,高糖各组血淋巴葡萄糖达到峰值后快速下降,峰值2 h后血淋巴葡萄糖水平仍高于空腹值,表现出不同程度的糖耐量受损。(2)高糖各组家蚕与空白组的家蚕相比,体重增长缓慢,葡萄糖浓度越高,对生长影响越明显。(3)组织病理学结果显示空白组表皮、皮细胞和基膜层细胞无明显变化;对照组表皮增厚,皮细胞增多和基膜层完整,胶原纤维大量增生且排列致密;模型组表皮薄,基膜层不明显,皮细胞和胶原纤维增生,但是排列紊乱。(4)各组家蚕创面组织PI3K、Akt、m TOR的m RNA转录水平和PI3K、Akt的蛋白表达量均先升高后降低;同时间段空白组表达量最低;12 h时MEBO组m RNA转录水平和蛋白表达量高,对照组高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);36 h时MEBO组PI3K、Akt的m RNA转录水平最高,对照组m TOR的m RNA转录水平和PI3K、Akt的蛋白表达量最高,差异具有统计学意义(P<0.05);84 h时模型组m RNA转录水平和蛋白表达量高,对照组高于MEBO组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)用高浓度(35%和40%)葡萄糖混合桑叶喂养的家蚕更早表现出血淋巴葡萄糖耐量受损和生长受到抑制现象,能表现出稳...

摘要：目的:(1)通过单细胞测序(single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq)技术分析糖尿病足创面愈合组织(healing diabetic foot ulcer,Healing DFU)和非愈合组织(DFU)中CC类趋化因子配体2(c-c motif ligand 2,CCL2)、非典型趋化因子受体1(atypical chemokine receptors 1,ACKR1)与组织干细胞、内皮细胞的关系,从而进一步探究其影响创面愈合的机制;(2)探讨MEBO湿润烧伤膏在小鼠DFU创面CCL2-ACKR1信号轴的活化作用以及通过影响内皮细胞的活性促进创面愈合的分子作用机制。方法:(1)通过单细胞测序技术分析Healing DFU、DFU创面组织中组织干细胞、内皮细胞基因本体(gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析结果;细胞亚群通讯数量、强度及相互作用差异性;进一步确定两种创面组织内特异性信号通路及其配体-受体对比分析;(2)我们将48只C57BL/6Jnifdc小鼠作为研究对象,随机将其分为4组,分别为急性创面组(Acute组,n=12),模型组(Model组,n=12),贝复新组(GF组,n=12),湿润烧伤膏组(MEBO组,n=12)。除外急性创面组,其余3组小鼠连续5天腹腔内注射链脲佐菌素(50mg/kg),连续饲养8周后取尾部静脉血确定模型建立成功性。待糖尿病模型建立成功后,在小鼠背部全层皮肤处制备缺损创伤模型,Acute组和Model组小鼠创面滴加生理盐水(20μL),GF组小鼠创面外用贝复新(20μL),MEBO组外用湿润烧伤膏(20μL),直到药物充分吸收。分别于DFU模型建立后3d、7d、14d取小鼠创面愈合组织。将各时点切取的组织一部分装入冻存管置入液氮中,并及时转移至-80℃冰箱,另一部分冰冻包埋剂处理,-20℃冰箱保存。确定各组小鼠创面愈合比率;观察各组小鼠3d、7d、14d创面愈合情况;免疫荧光化学染色分析14d后各创面组织内CCL2、ACKR1的表达;蛋白印迹法(Western blot,WB)分析各组小鼠3d、7d、14d创面CCL2、ACKR1的表达水平。结果:(1)创面相关的差异基因表达分析显示,愈合创面与未愈合创面的组织干细胞共有1948个差异基因,其中1198个基因被上调,685基因被下调;组织干细胞GO富集功能分析结果表明,其与创面愈合密切相关;组织干细胞中CCL2-ACKR1信号通路活性对内皮细胞亚群生物活性产生影响,最终促进DFU创面的愈合;(2)随着时间的延长,各组小鼠的创面组织体现出逐渐愈合的趋势,急性创面组小鼠愈合情况好于DFU模型组;贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预可以加速DFU小鼠创面的愈合情况,其中MBEO组体现出最好的疗效;(3)DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的荧光强度低于急性创面组;贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预均可以上调DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的强度,MEBO组创面组织内CCL2、ACKR1的荧光强度最高;(4)Acute组随时间变化其创面组织内的CCL2、ACKR1蛋白表达量呈现出持续升高的趋势,表达量明显高于Model组,贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预均可以上调DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的强度。结论:(1)DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1表达失调,MEBO的干预可以逆转DFU组小鼠创面组织内CCL2、ACKR1失调现象;(2)MEBO通过活化组织干细胞激活CCL2-ACKR1信号轴,促进创面组织血管内皮细胞的生成,最终促进创面愈合。

摘要：第一部分:小鼠慢性创面愈合过程中巨噬细胞极化类型及影响创面愈合关键的信号通路研究目的:经由单细胞转录组测序技术（sc RNA-seq）对小鼠创面内巨噬细胞（Mac）极化类型与成纤维细胞（Fib）、上皮细胞（EC）之间的关系,还有影响创面愈合的主要信号途径展开探讨。方法:经由sc RNA-seq法探究小鼠愈合创面（Wound）与未愈合创面（Un＿wound）组织在细胞亚群通讯强度、数量与互作方面的不同表现;对2类创面组织中特异性信号途径及其配体-受体加以明确,同时开展比较分析;并探讨小鼠Wound与Un＿wound组织中Monocyte亚群类型及其几类关键亚群类型。结果:（1）小鼠2类创面（Wound、Un＿wound）的单细胞质控Counts值皆未显示异常,细胞之间表现出较好的整体关联性。Wound组织中的细胞亚群以皮肤组织干细胞（Tissue SC）、EC、软骨细胞（Chondrocytes）、B细胞（B cells）、单核巨噬细胞（Monocyte）、Fib、内皮细胞（Endo）、角化细胞（KC）与T细胞（T cells）为主;Un＿wound组织中相关的细胞亚群以皮肤组织SC、T细胞（T cells）、波纹管细胞（CMP）、Monocyte、神经元细胞（Neurons）、Endo、EC、KC、Fibroblasts、软骨细胞（Chondrocytes）与B细胞（B cells）为主;在Wound组织中,Monocyte同EC、Fib、Tissue sc细胞亚群之间皆存在紧密联系;在Un＿wound组织内,就Monocyte同EC、Fib细胞亚群的通讯强度与数目而言,相较Wound组织皆偏低;（2）对于小鼠慢性创面组织Fib与Epithelial这2类细胞亚群,皆会受到Monocyte所含EGF信号途径CXCL1-Akr1信号轴的活化效应影响,CXCL信号途径内的不同配体-受体之间的作用性,对于整个信号途径,CXCL16-Akr6以及CXCL1-Akr1配体受体所具备的价值最高。对单个配体受体在不同细胞通信中的调控功能进行分析的结果显示,Cxcl3-Ark1配体受体于Mac与血管内皮细胞（VEC）的信号关联性更为显著,且更为关键;（3）Monocyte亚群由0、1、2、3、4、5这五类构成,前两类在Wound组织中占据主要位置,CD68与CD162特异性表达亚群存在比较明显的优势,同时CD163标记的Mono...

摘要：研究背景和目的糖尿病创面是糖尿病常见并发症,具有病程长、易复发等特点,给患者带来极大困扰,探寻其病理机制及治疗具有重要意义。巨噬细胞和成纤维细胞是创面中的重要效应细胞。现发现ADAM-10调控细胞粘附、生长、迁移等过程。但ADAM-10在糖尿病创面中的具体机制尚不明确。本研究探究ADAM-10在巨噬细胞、成纤维细胞中的调控作用;及其在糖尿病创面愈合过程中的作用机制;结合药物治疗创面,验证研究结果。研究方法1.临床上筛选慢性难愈合创面,随机分组:湿润暴露疗法/湿润烧伤膏(MM)组、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(rb-b FGF)组。在治疗第3、10天,取肉芽及少量上皮组织,免疫荧光(IF)染色ADAM-10、MMP-12,观察蛋白变化特点。2.对sh ADAM-10 RAW264.7细胞进行蛋白组学分析,筛选差异蛋白,并进行生物信息学分析。3.对RAW264.7和J774a.1细胞,进行sh ADAM-10(sh)或EX ADAM-10(EX)干预,随后给予脂多糖(LPS)或MMP-12抑制剂+LPS(MMP-12inh+LPS)刺激,检测细胞活力、基因转录、蛋白表达等情况。4.对L929成纤维细胞进行EX干预,随后LPS刺激,观察细胞活力、ADAM-10以及其它蛋白表达水平。5.正常、糖尿病大鼠分别制备创面,分组为急性(Acute)组、模型(Model)组、MM组以及rb-b FGF组。观察第3、7、10、14天的创面情况;创面率;病理结构;亚细胞结构;ADAM-10转录水平;蛋白表达及定位情况。结果1.慢性难愈合创面治疗第3天,MM组内ADAM-10、MMP-12表达均低于rb-b FGF组。相较于治疗第3天,第10天ADAM-10表达增加;MMP-12降低;MM增加ADAM-10作用低于rb-b FGF;rb-b FGF降低MMP-12作用明显。2.sh RAW264.7细胞蛋白组学检测结果显示:干扰ADAM-10影响创面愈合相关的多种生物学过程,并导致MMP-12和AKT降低。3.巨噬细胞中(1)对较于CON组,1000ng/ml的LPS作用9 h～24 h增加细胞活力(P<0.05);1.5μmol/L的MMP-12inh作用12 h～36 h对细胞活力无影响(P>0.05)。LPS作用12 h显著降低ADAM-10、增加MMP-12基因转录水平(P<0.01);LPS增加MMP-12、i NOS、T...