摘要：目的:体外高糖培养成纤维细胞(fibroblasts,FB),观察美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT)促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,(1)采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;(2)采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期(第3天)的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组(除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基)。分别予:(1)免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;(2)透射电镜检测细胞自噬体;(3)q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;(4)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:(1)细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度(optical density,OD)值均高于对照组(P<0.05),细胞增殖率在第72小时最高;(2)划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:(1)免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;(2)电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;(3)q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;(4)蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。

摘要：目的探讨分析湿润烧伤膏(MEBO)对糖尿病溃疡大鼠创面组织中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-1)及基质金属蛋白酶抑制剂-2 (TIMP-2)表达水平的影响。方法从160只健康雄性SD大鼠中随机选取120只制备大鼠糖尿病模型,其余40只正常喂养;最终选取90只造模成功大鼠随机分为模型组、MEBO组与bFGF组,每组30只,与此同时随机选取未予特殊处理的30只大鼠作为空白组,所有大鼠均做全层皮肤缺损创面,空白组与模型组大鼠创面予以凡士林油纱换药处理、MEBO组大鼠创面予以MEBO药纱换药处理、hFGF组大鼠创面予以重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)药纱换药处理,对比观察各组大鼠干预第4、6、12天时创面愈合率以及MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2与胶原蛋白水平变化情况。结果 (1)干预第4、6、12天,模型组大鼠创面愈合率均明显低于其他各组(P均<0.05),空白组大鼠创面愈合率均明显高于其他各组(P均<0.05),而MEBO组与bFGF组间无明显差异(P均>0.05)。(2)干预第4、6、12天,模型组大鼠创面组织中MMP-9及MMP-2 mRNA表达水平均明显高于其他各组(P均<0.05),TIMP-1及TIMP-2mRNA表达水平均明显低于其他各组(P均<0.05);除干预第6天MEBO组大鼠创面组织中TIMP-1 mRNA表达水平明显高于bFGF组(P<0.05)外,其余各时间点MEBO组与bFGF组大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达水平均无明显差异(P均> 0.05)。(3)干预第4、6、12天,模型组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显低于其他各组(P均<0.05);除干预第4天MEBO组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显高于bFGF组(P<0.05)外,其余各时间点MEBO组与bFGF组大鼠创面组织中胶原蛋白水平均无明显差异(P均>0.05)。结论 MEBO可通过调控糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的表达水平改善胶原蛋白过度降解,维持细胞外基质代谢平衡,进而促进创面愈合,调节MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2的比例失衡可能是其促进糖尿病溃疡创面愈合的作用靶点。

摘要：目的探讨湿润烧伤膏(MEBO)干预糖尿病性溃疡创面愈合的作用机制。方法将145只雄性健康SD大鼠随机分为空白组35只及糖尿病模型组110只,采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型,8周后选空白组30只及糖尿病成模大鼠90只(模型组、MEBO组及贝复济组各30只),制备溃疡模型,成功后MEBO组予湿润烧伤膏纱条、贝复济组予重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶液纱条、空白及模型组予生理盐水纱条局部换药处理,每日1次。给药后第3、6、12d,各组分别选10只大鼠,取相同位点创面组织,应用ELISA法检测组织匀浆中AGEs、NF-κB含量,荧光PCR技术检测组织中RAGE mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠第3、6、12d创面组织AGEs含量及RAGE mRNA表达量均显著升高(P<0.01),第3d创面组织NF-κB含量较低,第6d、12d含量持续升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,MEBO组第3、6、12d创面组织中AGEs含量及RAGE mRNA表达量均显著降低,贝复济组第3、6、12d组织中AGEs含量及第3d RAGE mRNA表达量显著下降,两组第3d创面组织中NF-κB含量均升高,第6、12d均明显下降,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论 MEBO促进糖尿病性溃疡创面愈合的机制与调控创面组织AGEs、NF-κB及RAGE mRNA的表达有关。

摘要：目的体外观察湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对糖尿病大鼠慢性创面纤维细胞生长的影响,探讨MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的机制。方法首先建立糖尿病创面大鼠模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成对照组、MEBO组(1 g/L),采用CCK-8法检测12、24、48、72、96 h细胞增殖情况,采用细胞划痕来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。结果 48 h起MEBO组各个时间点的OD值均高于对照组(P<0.05或0.001),细胞增殖率在72 h达到高峰;划痕实验检测显示,MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MEBO可促进糖尿病大鼠慢性创面成纤维细胞增殖与迁移能力。