摘要：目的:观察皮肤再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)对糖尿病大鼠溃疡创面组织中ULK1、p70S6K、4EBP1表达的影响,探讨其作用机制,为推广临床应用提供理论依据。方法:选取SPF级Wistar雄性大鼠250只,随机分为空白组、对照组、模型组、康复新组、MEBO组,每组50只。其中空白组大鼠仅予备皮处理,对照组大鼠建立常规创面模型,模型组、康复新组、MEBO组大鼠建立糖尿病大鼠创面模型。模型建立后,对照组、模型组大鼠创面予生理盐水外敷治疗,康复新组、MEBO组分别予康复新、湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)外敷治疗。各组分别于治疗第1天、第5天、第11天、第18天、第25天观察:(1)创面愈合情况、记录创面面积并计算创面愈合率;(2)创面组织HE染色观察病理改变;(3)免疫荧光法检测创面组织ULK1、p70S6K、4EBP1的表达;(4)电镜观察创面组织细胞自噬体数量、形态、结构的变化;(5)Western blotting法检测ULK1、p70S6K、4EBP1及其磷酸化水平;(6)q RT-PCR分析ULK1、p70S6K、4EBP1m RNA的表达。结果:(1)治疗过程中,对照组、康复新组、MEBO组创面愈合情况及创面愈合率均优于模型组。(2)治疗过程中,对照组、康复新组、MEBO组创面组织病理形态改善较模型组明显。(3)治疗过程中,各组创面组织中ULK1、p70S6K、4EBP1荧光染色阳性细胞数量及其平均光密度(OD)值均呈上升后下降的趋势,治疗早期MEBO组的阳性细胞数最多、OD值最高,模型组阳性细胞数最少、OD值最低。(4)治疗过程中,对照组、模型组、康复新组、MEBO组细胞内自噬体数量升高后降低,治疗早期MEBO组胞内自噬体最多。(5)治疗过程中,对照组、模型组、康复新组、MEBO组创面组织ULK1、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1表达均上升后下降,治疗早期,模型组的表达量最低,p-ULK1表达呈下降后上升的趋势,治疗早期模型组的表达量最高。(6)治疗过程中,对照组、模型组、康复新组、MEBO组ULK1、p70S6K、4EBP1m RNA表达均上升后下降,治疗早期模型组的表达量最低。结论:MEBT/MEBO可促进糖尿病溃...

摘要：目的:建立糖尿病溃疡创面大鼠模型,以细胞自噬和PI3K-Akt-mTOR信号通路为研究切入点,探讨皮肤再生医疗技术(湿润暴露疗法,Moist exposed burn therapy,MEBT/湿润烧伤膏,Moist exposed burn ointment,MEBO)促进糖尿病溃疡创面修复的机制,为临床推广应用MEBT/MEBO治疗糖尿病溃疡创面提供理论依据。方法:将80只健康雄性wistar大鼠随机分成糖尿病溃疡创面组60只、对照组20只。糖尿病溃疡创面组先进行适应性喂养1周,再予高脂饲料喂养4周,禁食16小时,再腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)45mg/kg,以空腹血糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功。1周后在大鼠背部建立直径约为2.5cm×2.5cm的全层皮肤切除模型,创面深度要求到达筋膜层,创面表面涂抹金黄色葡萄球菌悬浮液,造成糖尿病溃疡创面模型,再将其随机分为三组:MEBO组、康复新组和模型组,每组20只,分别采用MEBO、康复新液、生理盐水外敷进行创面处理。对照组大鼠在背部行全层皮肤切除,创面深度及大小与糖尿病溃疡创面组相同,但不予注射STZ,其创面也不涂抹金黄色葡萄球菌悬浮液。造模成功后各组动态观察创面的愈合情况,测量、计算各组大鼠的创面愈合率,并分别于第1天、第5天、第11天、第18天、第25天共5个时相点各组随机取4只大鼠,采集造模区创面组织后处死。将采集到的组织样品分别行常规病理技术观察创面组织形态学结构、电镜观察自噬体变化、Western blot检测PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)分析PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达情况。结果:1.创面愈合情况:对照组的创面修复最好,愈合时间最短;MEBO组、康复新组的创面修复情况显著优于模型组。创面愈合率:各组大鼠的创面愈合率均随着各时相点的增加呈逐渐升高趋势,在第5天,创面愈合率:对照组>康复新组>MEBO组>模型组,差异有统计学意义(P<0.05);第11天、第18天、第25天,创面愈合率:对照组>MEBO组>康复新组>模型组,差异有统计学意义(P<0.05),其中在第18天和第25天,MEBO组与康复新组之间对比差异均无统计学意义(P=0.76、0.23)。2.创面病理变化:第5天,MEBO组、康复新组及对照组的...

摘要：目的:体外高糖培养成纤维细胞(fibroblasts,FB),观察美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT)促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,(1)采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;(2)采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期(第3天)的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组(除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基)。分别予:(1)免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;(2)透射电镜检测细胞自噬体;(3)q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;(4)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:(1)细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度(optical density,OD)值均高于对照组(P<0.05),细胞增殖率在第72小时最高;(2)划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:(1)免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;(2)电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;(3)q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;(4)蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。

摘要：目的分析湿润烧伤膏(MEBO)对创面组织自噬信号因子Beclin1、LC3、p62的调控作用及其促进创面愈合的机制。方法选取SPF级Wistar雄性大鼠250只,随机分为空白组、对照组、模型组、康复新组、MEBO组各50只。对照组建立常规创面模型,模型组、康复新组、MEBO组建立糖尿病创面模型,对照组、模型组大鼠创面予生理盐水外敷治疗,康复新组、MEBO组分别予康复新和MEBO外敷治疗。分别于干预第1、5、11、18、25天观察创面愈合情况、苏木素-伊红(HE)染色病理及自噬体的变化;免疫荧光法及Western印迹检测创面组织Beclin1、LC3、p62的变化;qRT-PCR分析Beclin1、LC3、p62 mRNA的表达。结果治疗过程中,对照组愈合最快,模型组愈合最慢,早期各组创面愈合率无显著差异(P>0.05),晚期各组创面愈合率:对照组>MEBO组>康复新组>模型组(P<0.05)。对照组、康复新组、MEBO组创面组织病理形态改善优于模型组。对照组、模型组、康复新组、MEBO组创面组织中Beclin1、LC3平均光密度(OD)值上升后下降,p62 OD值下降后上升;细胞内自噬体数目升高后下降;创面组织Beclin1、p-Beclin1表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升后下降,p62表达下降后上升;Beclin1、LC3 mRNA表达上升后下降,p62表达下降后上升差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 MEBT/MEBO可有效促进糖尿病创面愈合,细胞自噬激活可能是其作用机制之一。