摘要：目的:(1)通过单细胞测序(single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq)技术分析糖尿病足创面愈合组织(healing diabetic foot ulcer,Healing DFU)和非愈合组织(DFU)中CC类趋化因子配体2(c-c motif ligand 2,CCL2)、非典型趋化因子受体1(atypical chemokine receptors 1,ACKR1)与组织干细胞、内皮细胞的关系,从而进一步探究其影响创面愈合的机制;(2)探讨MEBO湿润烧伤膏在小鼠DFU创面CCL2-ACKR1信号轴的活化作用以及通过影响内皮细胞的活性促进创面愈合的分子作用机制。方法:(1)通过单细胞测序技术分析Healing DFU、DFU创面组织中组织干细胞、内皮细胞基因本体(gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析结果;细胞亚群通讯数量、强度及相互作用差异性;进一步确定两种创面组织内特异性信号通路及其配体-受体对比分析;(2)我们将48只C57BL/6Jnifdc小鼠作为研究对象,随机将其分为4组,分别为急性创面组(Acute组,n=12),模型组(Model组,n=12),贝复新组(GF组,n=12),湿润烧伤膏组(MEBO组,n=12)。除外急性创面组,其余3组小鼠连续5天腹腔内注射链脲佐菌素(50mg/kg),连续饲养8周后取尾部静脉血确定模型建立成功性。待糖尿病模型建立成功后,在小鼠背部全层皮肤处制备缺损创伤模型,Acute组和Model组小鼠创面滴加生理盐水(20μL),GF组小鼠创面外用贝复新(20μL),MEBO组外用湿润烧伤膏(20μL),直到药物充分吸收。分别于DFU模型建立后3d、7d、14d取小鼠创面愈合组织。将各时点切取的组织一部分装入冻存管置入液氮中,并及时转移至-80℃冰箱,另一部分冰冻包埋剂处理,-20℃冰箱保存。确定各组小鼠创面愈合比率;观察各组小鼠3d、7d、14d创面愈合情况;免疫荧光化学染色分析14d后各创面组织内CCL2、ACKR1的表达;蛋白印迹法(Western blot,WB)分析各组小鼠3d、7d、14d创面CCL2、ACKR1的表达水平。结果:(1)创面相关的差异基因表达分析显示,愈合创面与未愈合创面的组织干细胞共有1948个差异基因,其中1198个基因被上调,685基因被下调;组织干细胞GO富集功能分析结果表明,其与创面愈合密切相关;组织干细胞中CCL2-ACKR1信号通路活性对内皮细胞亚群生物活性产生影响,最终促进DFU创面的愈合;(2)随着时间的延长,各组小鼠的创面组织体现出逐渐愈合的趋势,急性创面组小鼠愈合情况好于DFU模型组;贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预可以加速DFU小鼠创面的愈合情况,其中MBEO组体现出最好的疗效;(3)DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的荧光强度低于急性创面组;贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预均可以上调DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的强度,MEBO组创面组织内CCL2、ACKR1的荧光强度最高;(4)Acute组随时间变化其创面组织内的CCL2、ACKR1蛋白表达量呈现出持续升高的趋势,表达量明显高于Model组,贝复新及MEBO湿润烧伤膏的干预均可以上调DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1的强度。结论:(1)DFU小鼠创面组织内CCL2、ACKR1表达失调,MEBO的干预可以逆转DFU组小鼠创面组织内CCL2、ACKR1失调现象;(2)MEBO通过活化组织干细胞激活CCL2-ACKR1信号轴,促进创面组织血管内皮细胞的生成,最终促进创面愈合。

摘要：目的:体外高糖培养成纤维细胞(fibroblasts,FB),观察美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT)促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,(1)采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;(2)采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期(第3天)的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组(除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基)。分别予:(1)免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;(2)透射电镜检测细胞自噬体;(3)q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;(4)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:(1)细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度(optical density,OD)值均高于对照组(P<0.05),细胞增殖率在第72小时最高;(2)划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:(1)免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;(2)电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;(3)q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;(4)蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。

摘要：目的 探讨湿润烧伤膏(MEBO)治疗大鼠糖尿病性创面的作用及部分作用机制。方法 采用高脂饲料喂养及腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病大鼠模型，成模后将糖尿病大鼠随机分为模型组、MEBO组及重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用液(贝复济)组，与空白组同时制备创面模型后，分别予以相应药物干预治疗，MEBO组予以MEBO创面外敷，贝复济组予以贝复济创面外敷，空白组与模型组予以凡士林无菌纱布创面外敷。各组于干预治疗后第4、6、12天观察创面情况计算创面愈合率，分别取相同位点创面组织采用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miRNA-21和转化生长因子(TGF)-β1 mRNA表达，应用Western印迹检测创面组织中TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3和Smad7蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组第4、6、12天创面愈合率、创面组织中miRNA-21、TGF-β1 mRNA及TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3蛋白表达显著降低，Smad7蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组比较，MEBO组干预第6、12天创面愈合率、创面组织中miRNA-21、TGF-β1 mRNA表达及TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3蛋白表达显著升高，Smad7蛋白表达显著降低(均P<0.05)。结论 MEBO可能通过miRNA-21调控TGF-β1/Smads信号通路促进成纤维细胞迁移、增殖，促进糖尿病性创面修复。

摘要：目的 从细胞焦亡有关因子IL-18探讨大鼠慢性难愈合创面的修复机制。方法 取健康成年雄性大鼠60只，分笼饲养于右江民族医学院SPF级动物实验室1周后随机分为：空白组、急创组、贝复济组、美宝组、模型组，每组12只。其中空白组仅做背部脊柱两侧备皮处理，急创组直接进行背部创面造模，并湿敷生理盐水纱布。其余各组作慢性难愈合创面造模，分别用湿润烧伤膏（MEBO）、贝复济、生理盐水进行治疗。结果 治疗后第7天和第14天，急创组、贝复济组、美宝组大鼠创面愈合率均明显高于模型组（P <0.05），美宝组与贝复济组比较差异无统计学意义（P>0.05）。电镜结果显示模型组、美宝组中均存在细胞胀大，细胞破损，细胞内容物释放的细胞焦亡特征。分子生物学实验显示，造模后第3天、第7天、第14天，空白组大鼠皮肤组织中IL-18蛋白均无明显变化（P>0.05）。急创组、贝复济组、美宝组、模型组中IL-18表达水平变化明显（P <0.05），其中急创组、贝复济组、美宝组中IL-18表达水平呈先升高后降低趋势，模型组中IL-18表达水平在7d时先升高，14d后可维持在较高水平。但是急创组、贝复济组、美宝组IL-18表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（P <0.05）。结论 MEBO可以促进慢性难愈合创面的修复，愈合过程可能涉及创面细胞焦亡，其机制可能与调控IL-18蛋白表达水平有关。