摘要：目的:体外高糖培养成纤维细胞(fibroblasts,FB),观察美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT)促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,(1)采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;(2)采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期(第3天)的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组(除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基)。分别予:(1)免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;(2)透射电镜检测细胞自噬体;(3)q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;(4)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:(1)细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度(optical density,OD)值均高于对照组(P<0.05),细胞增殖率在第72小时最高;(2)划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:(1)免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;(2)电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;(3)q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;(4)蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。

摘要：目的分析湿润烧伤膏(MEBO)对创面组织自噬信号因子Beclin1、LC3、p62的调控作用及其促进创面愈合的机制。方法选取SPF级Wistar雄性大鼠250只,随机分为空白组、对照组、模型组、康复新组、MEBO组各50只。对照组建立常规创面模型,模型组、康复新组、MEBO组建立糖尿病创面模型,对照组、模型组大鼠创面予生理盐水外敷治疗,康复新组、MEBO组分别予康复新和MEBO外敷治疗。分别于干预第1、5、11、18、25天观察创面愈合情况、苏木素-伊红(HE)染色病理及自噬体的变化;免疫荧光法及Western印迹检测创面组织Beclin1、LC3、p62的变化;qRT-PCR分析Beclin1、LC3、p62 mRNA的表达。结果治疗过程中,对照组愈合最快,模型组愈合最慢,早期各组创面愈合率无显著差异(P>0.05),晚期各组创面愈合率:对照组>MEBO组>康复新组>模型组(P<0.05)。对照组、康复新组、MEBO组创面组织病理形态改善优于模型组。对照组、模型组、康复新组、MEBO组创面组织中Beclin1、LC3平均光密度(OD)值上升后下降,p62 OD值下降后上升;细胞内自噬体数目升高后下降;创面组织Beclin1、p-Beclin1表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升后下降,p62表达下降后上升;Beclin1、LC3 mRNA表达上升后下降,p62表达下降后上升差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 MEBT/MEBO可有效促进糖尿病创面愈合,细胞自噬激活可能是其作用机制之一。